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细胞破碎技术在生物制药工艺中的应用

热度0票 浏览42次 时间:2020年4月08日 09:38
赵玉萍 董鹏 黑龙江珍宝岛药业股份有限公司
摘要:生物制药是我国制药行业最具发展前景的产业,生物制药工艺的迅速发展,许多新技术被应用到生物制药中。
细胞破碎技术是当前生物制药工艺中比较常用的技术之一,具有较高的应用价值。细胞破碎技术在应用的过程中种类有很多,可以根据不同的需求对细胞破碎方法进行针对性的选择,不同生物体或者同一生物体的不同组织,细胞破碎的难易程度是不一样的,采用的方法也存在着较大的差别,需要对生物的细胞性质进行了解,选择最适合的破碎方法。进而,本文对细胞破碎技术在生物制药工艺中的应用进行了探讨。
关键词:细胞破碎技术;生物制药工艺;应用
生物制药的目标产物中有的分泌于细胞或组织之外,如抗生素、酶制剂等为胞外产物,有的存在于细胞内称为胞内产物。对胞外产物只需直接将发酵液预处理及过滤;而存在于细胞内的细胞产物,需先在不破坏其生物活性的基础上,将细胞和组织破碎,使目标产物转入液相,再进行细胞碎片的分离。细胞破碎技术是利用外力破坏细胞膜和细胞壁,使细胞内容物包括目标产物释放出来。
一、细胞破碎方法的分类
根据作用原理可将细胞破碎方法分为两类:机械破碎方法和非机械破碎方法。机械法主要是通过机械切力的作用使组织细胞破碎的方法。适用于破碎细胞的非机械法有物理法、化学法和酶解法等。
1、超声波震荡法
超声波震荡法利用超声波 15-25kHz 的机械振动而使细胞破碎的一种方法,是实验室规模最适合的细胞破碎方法。超声波发生时,产生空化作用使液体局部产生低压区,引起液体内部流动,漩涡生成与消失时,在细胞表面造成很大的剪切力,从而使细胞破碎。
影响超声波破碎的主要因素有超声波探头的性质、超声波的声强、频率、被处理液体的温度、体积、黏度和破碎时间。
2、高压匀浆破碎法
高压匀浆器是大规模破碎细胞的常用设备,处理量大,常在工业生产中应用。利用高压使细胞悬液通过针型阀的小孔,通过猛烈撞击阀杆,以高速与撞击环发生碰撞,流向低压区,由于突然减压和高速冲击作用,造成细胞破碎。在工业规模的细胞破碎中,对于酵母等难破碎的及浓度高或处于生长静止期的细胞,常采用多次循环的操作方法。
3、高速珠磨破碎法
高速珠磨机是另外一种常用的细胞破碎机械,最适合酵母菌和胶束状微生物菌体的破碎。将细胞悬液与玻璃小珠、钢珠或陶瓷珠一起快速搅拌或研磨,带动玻璃小珠等撞击细胞,作用于细胞壁的撞击作用和剪切力使细胞得以破碎。
4、渗透压冲击破碎法
渗透压冲击是较温和的一种破碎方法,将细胞放在高渗透压的溶液中(如一定浓度的甘油或蔗糖溶液),由于渗透压的作用,细胞内水分便向外渗出,细胞发生收缩,当达到平衡后,将介质快速稀释,或将细胞转入水或缓冲液中,由于渗透压的突然变化,胞外的水迅速渗入胞内,引起细胞快速膨胀而破裂。
5、冻融破碎法
由于冷冻,一方面能使细胞膜的疏水键结构破裂,从而增加细胞的亲水性能,另一方面胞内水结晶,形成冰晶粒,引起细胞膨胀而破裂。适合细胞壁较脆弱的菌体。将细胞放在低温下冷冻(约 -15℃),然后在室温中融化,反复多次而达到破壁作用。
6、酶溶破碎法
酶解是利用溶解细胞壁的酶处理菌体细胞,使细胞壁受到部分或完全破坏后,再利用渗透压冲击等方法破坏细胞膜,进一步增大胞内产物的通透性。溶菌酶适用于革兰氏阴性菌细胞的分解,应用于革兰氏阳性菌时,需辅以 EDTA 使之更有效地作用于细胞壁。
真核细胞的细胞壁不同于原核细胞,需采用不同的酶。
7、化学破碎法
采用化学法处理可以溶解细胞膜或细胞壁某些成分,从而使细胞释放内容物,达到破碎细胞的目的。常用酸、碱、表面活性剂和有机溶剂等化学试剂。
8、包涵体的破碎
包涵体是指异源的重组蛋白在宿主细胞中高水平表达,生成的无定形蛋白质聚集体,不具有生物活性,需进行结构改造。从包涵体中分离有活性的重组蛋白过程为:一是利用水解或高压的方法破碎细胞,二是低速离心法分离包涵体,三是利用变性剂溶解包涵体使其变性,但一级结构不发生变化,四是蛋白质进行复性,使其变成有活性的空间结构。
二、破碎效果的评价
破碎效果的评价主要就是对细胞破碎率进行评价,细胞破碎率主要指的是破碎细胞的数量和原细胞的数量比。在实际评价的过程中,可以采用以下几种方式:第一,显微镜评价法。可以利用显微镜对破碎的细胞进行观察和计算,破碎细胞和原细胞的状态是不一样,可以进行辨认,通常活细胞比较亮,而破碎的细胞呈现出黑影。但是还有一些细胞不容易进行辨认,可以通过染色的方法来进行分辨,然后进行破碎细胞数量的计算;第二,采用离心法,活细胞的纹理、颜色和沉淀的速率与破碎细胞是不一样的,可以根据活细胞和破碎细胞特点进行分辨,以此计算出细胞破碎率;第三,通过测定化合物的含量来确定细胞破碎的数量,完整细胞中的化合物含量与破碎细胞中的化合物含量是不一样,可以通过两者的差别来确定破碎细胞的数量,对破碎效果进行评价。
三、细胞破碎方法的选择
不同生物的细胞性质是不一样的,而且同一生物的不同组织,细胞破碎的难易程度都存在着较大的差异,选择的细胞破碎方法对也不同。在实际进行细胞破碎方法的选择时,需要根据细胞的性质进行选择,如果是在细胞质内提取相关物质,就可以采用机械破碎法;如果在细胞质的周围提出相关物质,可以采用非机械法;如果是细胞膜和细胞壁相结合,那么就可以将机械法和非机械法结合在一起。动物细胞没有细胞壁,在进行细胞破碎时可以采用研磨方法,对于其中韧性较强的组织,需要先将其搅碎,再进行后续操作。植物细胞和微生物细胞存在细胞壁,一般都会使用细胞破碎方法,对于植物中的肉质组织可以采用研磨的方式。而微生物一般会应用自溶、加砂研磨、加压法等,需要根据不同细胞性质进行选择。选择合适的破碎方法还需要考虑到细胞的数量、产物和细胞破碎后的敏感程度,还有需破碎的程度,通常都会选择比较温和的破碎方法。
结语:
细胞破碎技术在生物制药工艺中的应用,有助于生物制药事业的进一步发展。细胞破碎技术在应用的过程中方法有很多,在进行破碎方法的选择时,需要根据生物细胞的性质进进行针对性的选择,实现该项技术的有效应用,将细胞破碎技术的作用充分发挥出来,以此促进生物制药事业的长远发展。
参考文献:
[1]杨艳芳,赵懂懂 .细胞膜的破碎技术方法及应用 [J].农村经济与科技,2017,28(12):300.
[2]梁蕊芳,徐龙,岳明强 .细胞破碎技术应用研究进展 [J].北方农业学报,2013(1):113-114.

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